2.1 MEDIOS DE CULTIVO

2.1 MEDIOS DE CULTIVO

Son medios nutritivos preparados para el crecimiento de microorganismo bajo condiciones estériles.

2.1.1 AREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

 El laboratorio de cultivo de tejido debe disponer de un are destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicación de las plantas producidas; esta área es especialmente necesaria en los laboratorios de investigación y desarrollo y en los de producción comercial.

El laboratorio de cultivos de tejidos vegetales cuenta con diferentes áreas:

1.      Área de preparación: en esta área como su nombre lo indica se preparan los medios de cultivo. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, los platos caliente con agitación, y otros elementos; también debe incluir vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o la cámara de crecimiento.

2.      Área de lavado y esterilización: El área de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría y una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada, y también debe proveer basureros adecuados para el material vegetal, inorgánico y de vidrio que se deseche. El área de esterilización debe tener espacio para el autoclave vertical y horizontal, el cual puede ser pequeño (olla de presión) o grande (de carga frontal y de enfriamiento lento y rápido), según sea el volumen del material que se procese.

3.      Área de siembra, trasferencia o cámara de cultivo: se realiza el trabajo de escisión, inoculación y trasferencia de los espantes a los medios de cultivo, cuenta con campanas de flujo laminar y todos los accesorios necesarios para la inoculación.

4.      Área de crecimiento o incubación: Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o cámaras de crecimiento; estas pueden ser más eficientes en cuanto al control ambiental, pero son más costosas.

5.      Área de rusticación, aclimatación o de endurecimiento: es el área de aclimatación en donde los cultivos deben de estar en condiciones ambientales favorables para su crecimiento.

MATERIAL VEGETAL

v  Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento).

v  Explantes (elección, disección, esterilización, etc.). Tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio artificial de crecimiento.

CONDICIONES DE CULTIVO

Ø  Asepsia: Es la ausencia de microorganismos que producen enfermedades.

Ø  Recipientes: se utilizaran los recipientes adecuados para cultivar y propagar los cultivos de tejidos vegetales.

Ø  Temperatura: Las temperaturas apropiadas para el cultivo varían desde 24 a 26°C. Algunas especies pueden tener una menor tolerancia o requerimientos específicos.

Ø  Luz y fotoperíodo: Las intensidades de luz usadas tanto para cultivo de semillas como para cultivo de meristemas o yemas van desde la oscuridad hasta los 300 Lux, generalmente obtenidos con fluorescentes y algunas veces complementados con lámparas incandescentes. 

2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

AREAS	MATERIAL	EQUIPO
Área de preparación	Frascos Erlenmeyer, todo material de cristalería.	Refrigerador, balanzas, potenciómetro, plancha eléctrica.
Área de lavado y esterilización	Destilador de vidrio, gradillas, bandejas de aluminio	Autoclave, estufas para esterilización y secado.
Área de siembra	Instrumentos de disección: chuchillas, agujas de disección, pinzas, tijeras, navajas. También se utilizan mecheros de alcohol y bandejas	Gabinete de flujo laminar, microscopio de disección con luz incidente.
Área de crecimiento	Termómetros de máxima y mínima, gradillas para tubos.	Estanterías con iluminación para los cultivos y Aire acondicionado
Área de rusticación	Malla, terreno adecuado para el crecimiento de plantas, tubos para la malla.

CRISTALERÍA

Matraz Erlenmeyer	Es un contenedor similar al balón cuya función es calentar líquidos cuyos vapores no deben estar en contacto con la fuente de calor.
Tubos de ensayo	Es un tubo de vidrio, sin escalas, cuya función es disolver, calentar o hacer reaccionar pequeñas cantidades de sustancia.
Caja de petri	Es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética
Botellas para cultivar	Para propósitos de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan botellas cilíndricas o cuadradas, que pueden ser las botellas de whisky, ron, brandy, etc., que son resistentes a altas temperaturas y que son muy apropiadas para los medios de cultivo sólido.
Botellas para reactivos y soluciones madre	Se requieren muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100 ml, 500 ml para guardar soluciones madre o para hacer soluciones de varios reactivos. Las botellas oscuras son usadas para evitar la multiplicación de hongos y bacterias u oxidación causada por la luz.
Pipetas	Las pipetas son aparatos de medición de volúmenes de líquidos con bastante precisión. Son de cristal y están formadas por un tubo transparente con una graduación (ya sea una o más marcas) y termina en uno de sus extremos en forma cónicas.
Goteros	Consiste en un pequeño tubo de vidrio y en uno de sus extremos tiene un capuchón de hule, que permite succionar o arrojar las soluciones.
Probetas	Permiten medir volúmenes de forma aproximada, o transvasar y recoger líquidos. Se fabrican de distintos tamaños y materiales (vidrio y plástico), siendo las capacidades más frecuentes son 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.
Matraces	Se utilizaran matraces aforados y volumétricos. Matraces volumétricos: de 500 y 1000 ml y Matraces aforados: de 50, 100 y 250 ml
Vasijas de vidrio para la distribución de medio de cultivo	Para la distribución de un volumen de medio de cultivo se pueden usar diferentes formas, por ejemplo vasijas de vidrio, embudos grandes con tubos de hule y pinzas de compresión, columnas de vidrio con boca de salida o botellas de inyección de Linger o simplemente recipientes de aluminio, como jarras.
Jeringas dispensoras	Cuando son volúmenes pequeños de medios de cultivo es muy efectiva la pipeta automática del tipo Cornwall. Esta pipeta está diseñada especialmente para el traspaso automático de dosis repetida de mediciones exactas y con capacidad para 10 ml.

INSTRUMENTOS Y APATATOS

Filtros y esterilizadores	Para la esterilización del aire y líquidos se emplean filtros especiales. Uno de estos es el cilindro de diatomeas que es usado para líquidos y consta de una abrazadera y un matraz conectado a un extractor.
Cámara de flujo laminar	Es un receptáculo en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo, que normalmente permanece limpia y estéril.
Hornos para secado	Estos hornos se usan especialmente para el secado del material de vidriería lavado y para la esterilización de instrumentos usados para el cultivo. Para la esterilización por secado, la temperatura que se debe conservar es de 140°C durante 4h o bien a 150°C – 180°C por una hora, por lo que se requiere de un termostato que sea preciso.
Autoclave	Es un recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua.
Refrigerador y congelador	Células, tejidos y soluciones madres, se deben de conservar a bajas temperaturas y para ello se requiere un refrigerador.
Balanzas	La preparación del medio requiere de realizar el pesaje con precisión de todos los componentes que lo integran con precisión y de acuerdo al tipo y a la cantidad del constituyente que se agregue al medio, así será el tipo de balanza que se empleé.
Agitador metálico	Se utiliza para mezclar líquidos o preparar disoluciones y suspensiones.

BIBLIOGRAFIA

http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo1.pdf