martes, 21 de febrero de 2012

2.1.3 GENERALIDADES

 2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.
La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril.
El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como herramienta fundamental en un número importante de áreas y técnicas de la investigación y la producción vegetal, todas ellas relacionadas a lo que actualmente se conoce como biotecnología vegetal. A continuación se enumeran algunas de las más importantes:
§  Estudios básicos de anatomía, desarrollo y nutrición vegetal.
§  Variación somaclonal y gametoclonal a través de selección celular.
§  Aislación de protoplastos. Utilizado para realizar fusión celular (hibridación somática) e ingeniería genética .
§  Producción de plantas haploides a través de cultivo de anteras o cultivo de polen.
§  Rescate de óvulos fecundados y embriones de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos
§  Ingeniería Genética: incluye todas las técnicas que utilizan organismos vivos o sus componentes para producir o modificar sus productos. La variedad de aplicaciones incluye las áreas de energía, manejo medio ambiental y productos farmacéuticos y agrícolas.
§  Micropropagación vegetal. Propagación clonal o propagación in vitro o propagación vegetativa.
§  Embriogénesis somática.
§  Cultivo de meristemas para la eliminación de virus y enfermedades presentes en las plantas.
§  Producción de fitoquímicos o producción de sustancias de metabolismo secundario.

2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

a) carbono

b) nutrimentos minerales

c) vitaminas
d) agente gelificante (en el caso de medios sólidos)
e) sustancias reguladoras del crecimiento
f) otros compuestos

Fuentes de carbono: muy pocos  cultivos in vitro son autótrofos, por lo tanto es necesario agregar al medio una fuente de carbono. La sacarosa (2% a 5%) es el azúcar que más se utiliza y se puede reemplazar por glucosa y en menor medida por fructosa, en general, la maltosa y la galactosa son menos efectivas. La incorporación de mioinositol al medio  (100 mg/litro) generalmente da como resultado un mejor crecimiento de los callos y suspensiones celulares.
Nutrimentos minerales: cualitativamente los medios de cultivo aportan los mismos elementos (macro y micronutrientes) que se consideran esenciales para el crecimiento de las plantas enteras.

MACROELEMENTOS (G/L):
  • Fuente de carbono: puede ser CO2 ó compuestos carbonados orgánicos. Se utilizan en la construcción de innumerables moléculas necesarias para la célula. Los hidratos de carbono se consideran fuente de carbono y energía por excelencia en los quimioorganotrofos. Los más comunes son:
o   hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
o   pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
o   disacáridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
o   trisacáridos como rafinosa;
o   polisacáridos como almidón, glucógeno;
o   alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
o   glucósidos como salicina, y esculina.
  • Fuente de nitrógeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrógeno y pueden crecer utilizando moléculas sencillas como NO3-, NH3 ó N2. El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o pirimídicas.
En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrógeno es realizado por las peptonas, que son los productos de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas de origen animal o vegetal (carne, soja, caseína, gelatina, harina de maíz y girasol). Esos productos de hidrólisis pueden tener longitud variable, desde aminoácidos, hasta dipéptidos, tripéptidos, polipéptidos, albumosas, proteosas.
  • Fuente de fósforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que también confieren poder buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolípidos de la yema. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos, fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva (gránulos de volutina)
  • Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina. En la célula se incorpora a aminoácidos y diferentes coenzimas.
  • Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y magnesio se adicionan como sales inorgánicas. Son cationes que estabilizan macromoléculas aniónicas. K+ actúa como coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila en organismos fotosintéticos. Ca2+ abunda en esporas como dipicolinato de calcio.
  • Fuente de sodio: sodio contribuiría a equilibrar la presión osmótica del medio extracelular. Es un catión requerido por bacterias halofílicas. Se suele suministrar como NaCl.

MICROELEMENTOS O TRAZAS (MG Ó UG/ML): suelen estar naturalmente presentes como contaminantes de los macroelementos.
·         Frecuentemente esenciales:
Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulación.
Fe: cofactor de enzimas para la función respiratoria en citocromos, catalasa y flavoproteínas. En adecuada concentración favorece la síntesis de toxina diftérica.
Co: interviene en la síntesis de vitamina B12.
Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.
  • Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be, F, etc.
  • Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.     
  •    MACRONUTRIENTES
        SOLUCIÓN STOC (g/l)
       SOLUCIÓN CULTIVO (mg/l)
         KH2PO4
              5.44
                        34.0
         K2HPO4
              6.96
                        26.1
         MgSO4.7H2O
            49.3
                        49.3
         K2SO4
            17.4
                        17.4
         CaCL2.2H2O
            14.7
                        14.7
         KNO3
          101.1
                    1011.0
        EDTA disódico
              5.0
                         10.0
        MICRONUTRIENTES
         ZnCl2
              300
                           0.6
         MnCl2.H2O
             900
                           1.8
         FeSO4.7H2O
                3
                           0.6
        H3BO4
             2.86
                           5.7
        CuCl2.7H2O
              60
                           0.12
        NH4MoO4.H2O 
              250
                           0.5
        CoCl2
             15
                           0.03

VITAMINAS
Si bien los medios de cultivo contienen comúnmente varias vitaminas, es probable que en forma general solo sea esencial la incorporación de tiamina.
AGENTE GELIFICANTE
En los medios simisolidos comúnmente se adiciona agar (0.6% a 1.0%). Se debe considerar especialmente la pureza del agar, ya que es frecuente la presencia de impurezas de naturaleza variada.
REGULADORES DE CRECIMIENTO
En algunos casos se obtienen en los cultivos in vitro las respuestas deseadas mediante el empleo del MB sin reguladores de crecimiento.
Auxinas: Participan en división celular. Las auxinas más utilizadas en el establecimiento de los cultivos son: 2,4-D, ANA, AIA Y AIB. Son las primeras hormonas que se describieron. Su estructura es un derivado del fenol o el indol, y tienen anillos aromáticos con dobles enlaces conjugados. Todas son ácidos. Se descubrieron a partir del efecto de curvatura de los tallos al cortar su parte apical. No se sabe el modo de acción pero está relacionado directamente con su estructura, ya que si se modifica pierde su función.

Giberelinas (GA): en elongación celular.
Son hormonas que proceden de una estructura química, no de una función concreta. Su estructura química deriva del ent-giberelano. Es un grupo de hormonas muy heterogéneo, existen muchas formas aunque pocas con función.
Citocininas (CK): en división celular. Las más usuales KIN, BAP Y ZEA. Son un grupo más reducido de hormonas que deben su nombre a su función (citoquinesis). En conjunto con las auxinas estimulan la división celular. Derivan de adeninas, y las más frecuentes son la quinetina y benciladenina (sintéticas) y la zeatina (natural).
Otros componentes
Existe una larga lista de componentes que se han adicionado ocasionalmente a los medios de cultivo, como fuentes de nitrógeno reducido, factores de crecimiento, carbohidratos y otros. Entre ellos están agua de coco, AC, el jugo de  frutos de tomate, el extracto de levadura y el extracto de tubérculos.

2.1.5 PREPARACION Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK
Las soluciones stock son soluciones concentradas de nutrientes. Dependiendo de la capacidad del inyector, las soluciones stock se pueden preparar  con  concentraciones 50, 100 o 200 veces la concentración normal. Un segundo factor que puede delimitar el grado de concentración de la solución stock es la de la solubilidad del fertilizante.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución.
SALES MINERALS MS
(g/l)
(NH4 )NO3    
1.650
KNO3
      1.900
CaCl2.2H2O 
0.440
MgSO4.7H2O           
0.370
KH2PO4
0.170
FeSO4.7H2O
0.0278
Na2EDTA. 2H2O
0.0372
MnSO4.H2O
0.0169
ZnSO4.7H2O
0.0086
H3BO3           
0.0062
KI
      0.0008
      Na2MoO4.2H2O       
0.00025
CuSO4.5H2O           
0.000025
CoCl2.6H2O 
0.000025


2.1.6. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos.
Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante.
Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo
y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras.
El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C.

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